Chapter 5. Genomics, Proteomics, and Systems Biology

본 게시글은 학부 '세포생물학' 강의와 강의 교재("The Cell, A Molecular Approach / Geoffrey M. Cooper")를 토대로 작성되었습니다.

 

 

 

Contents

5.1 Genomes and Transcriptomes

5.2 Proteomics

 

5.3 Systems Biology

 

 

 

5.1 Genomes and Transcriptomes

Key points

• Bacteria와 Yeasts의 유전자 수를 비교
• Genome의 유전자 수를 비교
• 초파리, 애기장대의 Genome에 대한 Coding과 non-coding의 영향력
• 다른 척추동물(Vertebrate)에 대한 연구가 인간 유전체학을 이해하는 데 유용한 이유
• NGS에 사용되는 접근법과 개요 설명
• 유전자 발현을 연구하는 데 사용되는 글로벌 방법 설명

 

 

 

최초로 완전한 염기서열을 가지게 된 세포 genome은 Bacterium Haemophilus influenza

 

• The first complete sequence of a cellular genome was the bacterium Haemophilus influenza
• Approximately 1.8 x 10^6 base pairs
• Open-reading frames : long stretches of nucleotide sequence that can encode polypeptides

 

ORF(Open-reading frames)는 항상 시작코돈과 stop 코돈이 존재한다. 시작코돈 ~ 종결코돈

 

The genomes of Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, and Arabidopsis thaliana

위 테이블을 보면 Mammals, Human 개체의 경우 coding genes가 20,000개 임을 보여주고 있다. 하지만 이는 protein이 20000개라는 것이 아니라는 점 주의하자.

 

인간에게만 존재하는 유전자는 약 300개 정도

 

 

Next-generation sequencing and personal genomes

Next-generation sequencing(NGS)

Next-Generation sequencing(NGS). 차세대 염기서열 분석.

염기서열 분석의 시초인 생어법은 한 번에 한 유전자 서열만 읽을 수 있었지만, NGS가 도입이 되면서 수 천개, 혹은 그 이상의 유전자 서열을 한 번에 읽을 수 있었다. NGS는 분석 속도를 늘리고, 서열 분석에 드는 비용을 훨씬 줄일 수 있게 되었다.

• 일반적 NGS 과정
  1. DNA Fragmentation(라이브러리 제작)
  2. DNA Amplification by PCR
  3. DNA sequencing
  4. Sequencing assembly

 

 

RNA-seq

세포에서 mRNA를 분리하고, 역전사 효소(Reverse transcription)에 의해  cDNA로 변환된다. 그리고 이는 NGS를 통한 처리 과정을 거친다.

편집이 된 mRNA를 역전사 하였기 때문에 cDNA에는 인트론이 존재하지 않는다.

 

RNA-seq을 비롯한 다양한 방법에 대한 설명은 블로그 생물정보학 카테고리 글을 참고할 것.

 

 

 

 

Global analysis of gene expression

DNA microarrays(DNA 미세배열)

 

주의! cDNA에는 non-coding sequence가 없다.

 

...a.k.a DNA chip assay

• 어떤 세포에서 발현되는 많은 mRNA들을 한꺼번에 분석하고 세포들 사이의 유전자 발현 차이를 비교하는 실험 기법
• 수만 개의 유전자 발현을 동시에 분석할 수 있다.
• Oligonucleotides, 무작위로 ssDNA를 합성하거나 mRNA와 동일한 서열의 ssDNA를 합성해서 칩(Chip)위에 심는다.
  • 한 구멍에는 같고 다른 구멍끼리는 각각 다른 DNA가 심어진다.

 

1. Chip 위에 다양한 외가닥의 DNA를 합성해서 차례로 심는다.
2. 정상세포, 암세포를 각각 파쇄해 전체 mRNA를 추출한다.
3. 각각의 전체 mRNA에 서로 다른 형광 표지 핵산을 섞어서 역전사 반응을 진행한다.
4. 합성된 cDNA들을 칩에 뿌려 혼성화시킨다.

 

 

 

 

 

5.2 Proteomics

 

Proteomics란?

Large-scale analysis of cell proteins, 세포에서 관여하는 단백질, 단백체에 대하여

 

 

 

 

keypoint

Mass spectrometry(질량 분석기)로 단백질을 특정하는 방법을 설명해볼 것

세포 소기관의 단백체(Proteome) 분석을 위해 사용된 접근법(방법론)을 요약해볼 것

단백질 간 상호작용을 특정하기 위해 사용된 접근법, 방법론을 설명해볼 것

 

* Protein을 분석하려면 mass spectrometry가 필요하다.

 

Identification of cell proteins

Mass spectrometry란?

 

 

 

Global analysis of protein localization

단백질 위치를 확인하는 범용적 분석법

 

Immunofluorescence

 

 

Protein interactions

 

Immunoprecipitation(a.k.a IP 실험)

 

1. 단백질(A or G)이 코팅된 구슬과 특정 항체를 섞어서 결합시킨다.
   • 여기서 Protein A 또는 G는 antibody Fc 부분과 결합하는 성질을 가지고 있다.
2. 항체가 부착된 구슬을 세포 파쇄물과 섞는다.
3. 구슬이 가라앉을 때 항체와 결합한 단백질들이 함께 침전된다.
4. 침전물에서 항체에 결합했던 단백질들을 떼어서 전기영동을 수행한다.

• 세포 파쇄물 속에 항체와 결합력이 있는 단백질의 존재 여부를 알 수 있다.
• 세포 파쇄물 속에 항체와 직접 결합한 단백질과 붙는 다른 단백질이 있다면, 구슬이 침전될 때 함께 침전돼서 밴드로 나타날 수 있다.

• 세포 추출물과 다른 단백질과 어떤 연관성이 있는지를 밝혀낸다.
• 전체 복합체는 Mass spectrometry(질량 분석기)로 분석하여 상호작용하는 단백질을 식별할 수 있다.

 

 

ChIP(Chromatin immunopreipitation assay, 염색질 면역 침전법)

전사인자 등을 알아낼 수 있는 기법이다.

1. DNA에 포름알데히드를 처리해서 DNA와 상호 작용하고 있던 단백질들을 고정한다.
2. 초음파 처리를 하여 DNA를 짧게 절단한다.
3. 단백질(A or G)가 코팅된 구슬과 특정 항체를 섞어서 결합시킨다.
4. 항체가 부착된 구슬을 세포 파쇄물과 섞는다.
5. 구슬이 침전할 때 항체와 결합한 단백질들이 함께 침전된다.
6. 침전된 단백질에 붙어있던 DNA를 용출해서 염기 서열을 분석한다. 이 때, 특정 단백질과 결합하는 DNA 서열을 찾을 수 있다.

 

Yeast two-hybird system

단백질들 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 실험 기법

효모에서 표적 유전자의 발현을 자극하는 단백질의 두 개의 서로 다른 도메인에 두 개의 서로 다른 cDNA가 결합되어 있다.

 

 

한 예로, 효모의 Gal4 전사인자와 그 결합 서열인 UAS(Upstream activation sequence, enhancer 서열 중 하나)를 활용한다. 두 벡터에 각각 Gal4의 일부 도메인 유전자와 결합 여부를 알고 싶은 단백질의 유전자를 넣어서 융합 단백질이 번역될 수 있도록 한다.

• 1번 벡터 : Gal4 활성화 도메인 + 결합 여부를 알고 싶은 단백질 1 -> 융합 단백질 1 합성
• 2번 벡터 : Gal4 DNA 결합 도메인 + 결합 여부를 알고 싶은 단백질 2 -> 융합 단백질 2 합성

융합 단백질 1이 융합 단백질 2와 결합하게 되면 LacZ 유전자가 발현될 것이고 이는 파란색 콜로니로서 확인이 가능할 것이다. 반대로, 융합 단백질 1이 융합 단백질 2와 결합을 하지 못하면 LacZ 유전자 발현이 되지 않아 하얀색 콜로니가 관찰될 것이다.

 

Keypoint

• 단백체학(Proteomics)의 주요 목표는 세포 내 전체 단백질, 즉 단백체를 특성화하는 것이다. 여기에는 단백질의 기능, 구조 및 상호작용을 이해하는 것이 포함된다.
• 질량분석법은 개별 단백질을 식별하거나 복합 혼합물 내 단백질을 분석하기 위해 사용되는 강력한 기술이자 도구이다. 이기술은 고립된 단백질뿐만 아니라 복합 혼합물에 포함된 단백질의 대규모 분석에 필수적이다.
• 세포 소기관(Subcellular organelles)의 단백질 구성은 Mass Spectrometry(질량 분석법)을 사용하여 정빌하게 식별할 수 있으며, Large-scale immunofluorescence(대규모 면역형광법)을 사용하여 소기관 내 단백질의 시각화 및 정량화할 수 있다.
• 단백질 간 상호작용은 세포에서 protein complex를 정제하여 분석하거나 단백질을 효모 시스템에 도입하여 상호작용을 연구한다. 이러한 연구를 통해 세포 행동과 기능을 조절하는 복잡한 단백질 상호작용(세포 내 조절) 네트워크를 이해할 수 있다.

 

 

5.3 Systems Biology

 

생물학 분석의 과거와 현재

과거 전통 생물학은 발견을 하고 이의 차이 등을 분석하여 밝혀내는 방식을 취했던 반면, 현재는 Omics analysis. 차이를 발견한 후 이에 대해 타겟팅을 해서 찾아내는 방식을 취한다.

 

 

Systematic screens of gene function

 

RNAi(RNA interference, RNA 간섭)

게놈 전체 RNAi 분석은 배양 중인 세포의 성장과 생존에 필요한 유전자를 식별하는데 사용할 수 있다.

siRNA와 miRNA는 유래가 다르지만 repress 원리는 동일

 

1. 발현을 억제하려는 유전자의 일부 절편을 정상 방향과 뒤집은 방향으로 연속적으로 벡터에 삽입한다.
2. 벡터를 세포에 도입하면 삽입된 서열이 전사되면서 작은 헤어핀 RNA를 생성한다.

그 결과, siRNA로 작용해서 표적 유전자들의 발현을 억제하게 된다.

 

RNAi 했다는 것은 발현을 억제했다는 명제와 같다고 봐도 무방하다.

 

 

 

Networks

 

Signaling pathway

 

• 세포 신호의 대표 물질 : G-protein

위 사진을 예로 들면, 아드레날린(에피네프린)은 뉴런에서도 많이 나오는 신경전달물질. 아드레날린 수용체가 세포막에 분포하고 있을텐데, 아드레날린 수용체는 G protein 알파, 베타, 감마라고 하는 G 단백질과 결합을 하고 있다.

G-protein은 andenylyl cyclase 효소를 활성화 시킨다. 이 효소는 ATP에서 cAMP를 만들도록 하는데 이 cAMP는 2차 전달자로서 역할을 수행한다.

 

신경세포에서 자주 보이는 network

여러 피드백이 있는데, 여러 경로들로 하여금 회로를 이룬다.

Neuroscience에서 system biology 중 system neuroscience 분야 관점에서 뇌에는 신경세포가 약 천억 개가 존재한다고 한다.

그 천억 개의 신경세포는 물리적으로 조금씩 떨어져 있고 회로를 이루게 된다. 누군가는 억제를 시키고 누군가는 활성화를 시키는 것.

 

Synthetic biology

 

합성생물학

 

공학적 접근 : 생물학적 시스템을 이해하고 조작하기 위한 공학적 접근법

새로운 시스템 설계 : 새롭고 인공적인, 비자연적 또는 합성적, 생물학적 시스템을 설계하고 구축한다.

 

Keypoint

• System biology는 대규모 데이터셋을 사용하여 생물학적 시스템의 정량적 실험 분석 및 생물학적 시스템 모델링을 위해 대규모 데이터셋을 사용한다. 유전자 기능에 대한 게놈 전체 스크린(Genome-wide screen), 유전자 발현의 조절, 조절 네트워크의 정량적 모델링 등을 포함한다.
• Synthetic biology는 유전자를 포함한 새로운 생물학적 시스템을 설계하는 공학적 접근 방식. 경로 및 합성 genome을 포함한 시스템을 설계한다.